Inmunoelectroforesis
Practica 13
Identoificación de proteínas por inmunoelectroforesis
Fundamento.
La inmuno electroforesis es una técnica de separación e identificación de sustancias (habitualmenteproteínas) que atraviesan dos fases. Durante la primera fase, separamos las proteínas de la muestra mediante una electroforesis convencional en agarosa. En la segunda, se practica la difusión del Ag (proteína) y del Ac (sueroantiproteína) permitirá que ambos se unan y reaccionen entre si formando un complejo AG-AC que se hará visible en forma de unos arcops de precipitación.Objetivo.
Separar proteínas contenidas en un suero e identificar en el la posible presencia de Albúmina e IgG.Componentes del kit.
A: Ig G
B: Suero sanguíneo
C: Albúmina
D: Anticuerpos frente al suero
E:Anticuerpo frente a la Ig G
F: Polvo de agarosa
G: Tampón de electroforesis concentrado
- Papel de filtro
- Pajitas para perforar los pocillos
- Placas petri
Procedimiento
1.Preparamos el tampón de electroforesis en una bureta de 1000ml diluyendo el total (38ml) del bote que lo contiene en forma concentrada (componente G del kit) en 912ml de agua destilada para obtener un volumen total de tampón de 950 ml. Este tampón lo usaremos para preparar la agarosa y realizar la electroforesis.
NOTA: las cantidades son menores que en el protocolo ya que nos faltaba 2ml de tampón.
2.Preparamos las solución para el gel de agarosa:
-Añadimos el contenido total del sobre que contienen la agarosa (componente F) en 100ml de tampón de electroforesis obtenido en el paso anterior. Para ello utilizamos un frasco erlenmeyer de 500 ml. Con un rotulador, marcar el nivel alacanzado por el tampón.
-Le ponemos un tapón de papel al frasco erlenmeyer y calentamos la mezcla en el microondas hasta disolver el polvo de agarosa (1 minuto a máxima potencia sacandolo de vez en cuando para moverlo y hasta que empiece a hervir). Al final la solución debe ser transparente y no debe contener partículas sin disolver.
-Enfriamos la solución hasta 60ºC em el baño termostatico
3.Construimos un molde para los carriles utilizando una placa de petri pequeña y 4 portaobjetos.
4.Pipeteamos la cantidad necesaria de gel de agarosa (100ml) en la bandeja de la cubeta de electroforesis procurando que cubra el fondo uniformemente y no forme burbujas. Antes de que solidifique, introducimos en el centro del gel el molde para los carriles.
5.Cuando el gel ha solidificado, extrayendo cuidadosamente el molde para los carriles.
Realización de la electroforesis
1.Hacemos los pocillos en el gel con ayuda de una pipeta pasteur recortada. Dejando 0.5cm de distancia entre cada pocillo y los carriles contiguos. Eliminamos la agarosa de los pocillos con una aguja y otro elemento punzante y fino.
2.Coloca la bandeja con el gel en la cubeta de electroforesis y disponemos papel de filtro en cada uno de sus extremos de manera que sobresalga hacia el exterior. Este papel esta empapado de tampón.
3. Vertimos tampón en cada uno de los vasos de la cubeta de electroforesis hasta llenarlos y asegúrate de que eñl papel de filtro que sobresale de los extremos del gel de agarosa estésumergido en el papel de filtro que sobresale de los extremos del gel de agarosa están sumergidos en el tampón .
NOTA: no se cubre el gel con el tampón.
4. Dispensa 20 ul de cada Ag( A, B y C) en los pocillos correspondientes (A en el superior, B en el central, C en el inferior).
NOTA: cambiar las puntas de la pipeta entre Ag y Ag.
NOTA: aquí cometimos un fallo que fue introducir los componente O y E ya
5. Cerramos la tapa de de la cubeta de electroforesis y conectamos los polos respetando la polaridad y teniendo en cuenta que los Ag a identificar están cargados negativamente.
6.Conectamos la cubetaen la fuente de alimentación y aplicamos un voltaje de 125V durante 30-45 min. Mantenemos la corriente hasta que el colorante que acompaña a la muestra se acerque al final del gel de agarosa.
NOTA: no pudimos observar nada.
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