Ouchterlony

Práctica 12

Interacción antígeno-anticuerpo. El procedimiento Ouchterlony

Objetivo:

Introducir los principios de las interacciones antígeno-anticuerpo usando el procedimiento Ouchterlony.

Componentes:

• Antisuero (anticuerpo)
• Suero total (antígeno)
• Albúmina (antiígeno)
• IgG (antígeno)
• Tampón en polvo
• Agarosa UltraApec
• Tubo de solución de carga para practicar 
• Tubos microtest
• Pipetas de transferencia
• Platilla para corte de pocillos
• Cortadores para pocillos
• Placas de petri.

Material requerido y no sumisnistrado:

• Envase de plástico o placa Pyrex
• Baño de agua
• Micropipetas automáticas y puntas
• Baño de agua
• Espátula o mandadientes
• Agua destilada
• Pipetas
• Rotulador
• Microondas
• Toallas de papel
• Envoltura o lámina de plástico.

Preparación de antígenos y anticuerpos:

1.Se etiquetaron 10 eppendorf como A
2.Se etiquetaron 10 eppendorf como B
3.Se etiquetaron 10 eppendorf como C
4.Se etiquetaron 10 eppendorf como D
5. Alicuotaron 100 ul de muestra A en cada tubo A
6. Alicuotar 200 ul de muestra B en cada tubo B
7. Alicuotar 150 ul de muestra C en cada tubo C
8. Alicuotar 80 ul de muestra D en cada tubo D.
9.Repartir a cada grupo un tubo A, B, C y D.
Nota: los reactivos se dejaros preparados unos días antes.

Práctica:

Preparación de agarosa:
1.En un vaso de precipitados de 500ml, agregamos todo el contenido del paquete de tampón en polvo (componente E) a 225 ml de agua destilada. Agitamos el vaso para disolver totalmente el polvo.

2.Añadir todo el contenido de Agarosa al vaso de precipitados (3gr).Agitamos la suspensión para dispersar los grumos. Con un rotulador, indicar el nivel de volumen de la solución en elexterior del matraz o vaso de precipitados.

3. Se debe calentar (hasta punto de ebullición) la solución para disolver la agarosa.
Calentando la mezcla en un microondas, retirando ocasionalmente el vaso del calor y verificar que no haya partículas pequeñas y claras de agarosa, hasta llegar a una solución clara y transparente.

4.Como se produció una evaporación detectable, agregamos unas gotas de agua destilada
5. Enfriamos la solución de agarosa a 55ºC e el baño termostático.

6.Preparar alícuotas de 25 ml de la solución de agarosa para cada uno de los diez grupos.

Preparación de las placas Ouchterlony.
1.Pipetearon 5ml de la agarosa líquida en cada placa para cubrir el fondo con agarosa.

2.Si la agarosa líquida contiene burbujas, agitar suavemente la placa para eliminarlas.

3.Permitir que la agarosa se solidifique. Esto tardará aproximadamente 10-15 minutos, en cuyo momento el gel aparecerá un poco opaco.

Preparación de pocillos patra la muestra.
1.Colocamos la plantilla debajo de una de las placas para que el patrón esté en el centro de la placa.Las distancias entre los pocillos son importantes.

2.Cortar los cinco pocillos con la pipeta recortada con un suave movimiento de perforación. Retiramos la agarosa con una aguja.

Carga de las muestras en pocillos:
1.Identificamos cada placa.
2. Yo me encarge de la placa 1, donde tube que echar 30ul del tubo A en el pocillo central y en los demás pocillos 30ul del tubo B.

3.La placa 2 la hizo Isa, echando en el pocillo central 30ul del tubo A, en el pocillo superior izquierdo y pocillo superior derecho 30 ul de tubo B, y hacemos los mismo con los otros pocillos pero con albúmina del tubo C.

4.Cande hizo la última placa, echando en el pocillo central 30 ul del tubo A, 30 ul del tubo D en los pocillos superior izquierdo e inferior derecho y con los otros lo mismo pero con albúmina D.

Incubación:

Colocamos las tapas a las placas y las colocamos con cuidado, las placas cubiertas en la cámara de incubación sobre una capa de toallas de papel húmedas. Cubrimos ñas cámara con papel de aluminio y dejamos incubar a temperatura ambiente.